于洋合作團隊建立揭示生命早期發育奧秘的新模型——人造胚胎

2019年10月18日,美國索爾克(SALK)生物學研究所Belmonte課題組、德克薩斯大學西南醫學中心吳軍課題組及北京大學第三醫院于洋課題組等在Cell雜志發表題為“Generation of blastocyst-like structures from mouse embryonic and adult cell cultures”的研究論文,報道利用擴展多能性干細胞在體外構建功能性的胚胎結構,而不經過傳統受精方式。這個新模型未使用配子,可以以高通量方式揭示早期胚胎的發育機制,并構建機體各部分類器官,具有巨大潛力和應用價值。

胚胎發育是哺乳動物個體形成過程中的起始環節,但其數量的稀缺性決定這一過程中的奧秘很難利用傳統技術來揭示。近年來,單細胞測序技術及胚胎體外重組技術的出現,使得人們逐漸揭開哺乳動物早期發育的神秘面紗。然而,單細胞測序技術發現的關鍵分子驗證仍然需要大量的胚胎完成,而胚胎體外重組技術使用的兩種類型細胞,決定了該技術僅能夠重現囊胚期之后的胚胎結構,無法探索早期發育的生物學現象。因此,是否可以利用干細胞構建早期發育的胚胎從而更精準地模擬哺乳動物早期發育過程并探索其中的分子事件,值得深入研究,但目前尚無報道。

本研究利用擴展多能性干細胞(EPS)早期胚胎三種譜系均有貢獻的能力,將分離的小鼠EPS細胞接種到微孔中(每個微孔5個細胞),形成小的聚集體。通過建立KSOM-ETS的條件培養基,同時聯合應用FGF4、肝素、BMP4、CHIR99021和A83-01等小分子,及ROCK抑制劑Y-27632處理EPS細胞,可以獲得與小鼠E3.5自然受精囊胚形態相似的類囊胚結構。研究人員進一步將耐嘌呤霉素和mCherry+EPS細胞與野生型EPS細胞以1:10的比例混合用于初始培養。24小時后,在分化培養基中加入低濃度的嘌呤霉素,以逐漸消除輔助細胞。利用這種策略,我們可以從單個EPS細胞中產生克隆性EPS囊胚,效率為2.7%。
E3.5小鼠囊胚有兩種細胞系,即外滋養層(TE)和內細胞團(ICM)。我們檢查了類囊胚是否也有這兩種早期胚泡譜系。免疫熒光分析顯示,類囊胚外層的細胞表達TE轉錄因子CDX2和EOMES,內層細胞中表達SOX2、NANOG和OCT4。在檢測的140個類囊胚中,74.2%正確表達了TE-(CDX2+)和ICM(SOX2+)的譜系,15%只表達TE的譜系,1.4%只表達ICM樣譜系,9.3%類囊胚中的TE和/或ICM的譜系定位錯誤。計算第4—6天類囊胚中TE和ICM的細胞數量,第4天和第5天的類囊胚在兩個譜系中的細胞數量都少于E3.5自然受精囊胚,第6天兩個譜系中的細胞數量與E3.5囊胚細胞數量相當。
隨后,合作團隊研究了早期植入前發育的關鍵細胞和分子事件是否可以在類囊胚形成過程中被重現。在種植后的4h內,發現細胞之間的連接松散。在種植后18小時左右,細胞開始形成緊密的聚集體,細胞粘附蛋白E-鈣粘蛋白和緊密連接蛋白ZO1開始在細胞-細胞連接處聚集。隨后,研究團隊發現在種植后的第3天,75%細胞聚集物呈現PAR6富集的極化特征。這些數據支持了類囊胚的形成,證實了早期植入前發育的致密化及極化特征的觀點。
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為了深入了解類囊胚和自然受精囊胚在各個譜系中的異同,研究團隊利用單細胞RNA測序技術,對從類囊胚和自然受精囊胚中收集的2700多個單細胞的轉錄體進行了分析。利用SEURAT進行的綜合分析顯示,來自類囊胚和自然受精囊胚的細胞基本上重疊在一起。聚類分析將所有細胞分為7個簇,其中4個簇由類囊胚和自然受精囊胚共享。為揭示EPS囊胚和囊胚在各個譜系中的差異,研究團隊對差異表達基因進行了功能注釋。兩個樣本之間的ICM或EPI譜系鑒定出53個差異表達基因,這些差異表達基因富含與干細胞維持、繁殖和DNA甲基化相關的功能項。兩種多能性基因Sox2和Klf2在較低水平上表達(分別為28%和43%),Tet1和Dnmt3L,兩種DNA甲基化相關酶基因,在類囊胚中表達水平降低了18%。對于PE譜系,在類囊胚和自然受精囊胚之間鑒定出67個差異表達基因,并且這些差異表達基因大多與囊泡運輸和內吞有關。對于TE譜系,在兩個樣本之間僅發現兩個差異表達基因(Gjb2和Arhgel6)存在顯著差異。
利用體外體系對類囊胚結構進行長期培養,研究團隊證明類囊胚經過體外培養可以產生一個圓筒結構,外胚層和EPI作為兩個半球被內胚層包圍。在培養的類囊胚中,觀察到F-肌動蛋白在EPI樣中心富集,細胞呈玫瑰花狀結構,與小鼠E4.5–E4.75期的著床胚胎相似。極性蛋白aPKC排列在形成EPI樣腔的細胞內,具有E5.25-E5.5胚胎的特征。

一個更嚴格的功能測試是驗證它們是否能在子宮內發育成胎兒。為此,研究團隊將類囊胚移植假孕小鼠的子宮中,在7.5 dpc時,自然受精囊胚移植小鼠和類囊胚移植的小鼠子宮內均形成蛻膜。染色證實了類囊胚來源的植入部位的血管通透性。移植實驗從幾個不同的系中產生的EPS囊胚進行,移植類囊胚中有7%植入并誘導蛻膜化。然而類囊胚產生的蛻膜的大小有所不同,有些與對照蛻膜相似,有些則小得多。利用特異標記的td-tomato基因的引物對其基因組進行PCR分析,明確蛻膜組織含有來源于類囊胚的td-tomato陽性細胞。免疫組化分析也證實了td-tomato陽性細胞的存在。此外,研究團隊觀察到,在6.5、7.5和8.5 dpc時,在類囊胚衍生蛻膜內形成了一些結構,與對照組相同時期胚胎相比,這些結構都顯得發育遲緩或畸形。盡管如此,還是能夠在從這些結構制備的切片中檢測到OCT4+、EOMES+和GATA4+細胞的存在。這些結果提示類囊胚可以在子宮內植入、觸發蛻膜化并繼續生長。

該研究通過結合干細胞生物學、發育生物學和3D培養等多種手段,揭示了生命可以不從受精,而從單一細胞啟動發育。研究人員相信,通過進一步優化體系并結合基因編輯技術,能夠獲得功能更加完整的類囊胚,發育到形成不同器官原基的階段,從而成為類器官種子,用作器官移植的重要來源。

美國索爾克生物學研究所RonghuiLi,CuiqingZhong博士后及北京大學第三醫院生殖醫學中心/臨床干細胞研究中心于洋副研究員為本文共同第一作者,美國索爾克生物學研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte教授和德克薩斯大學西南醫學中心吳軍助理教授為通訊作者。

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Juan Carlos Izpisua Belmonte,索爾克生物學研究所Roger Guillemin講席教授。共發表學術論文470余篇,其中超過50篇發表在CNS期刊上,獲專利19項,入選2013年Science雜志評選的世界十大年度突破,獲得相關獎勵37項,受邀參加350余次國際會議,進行大會keynote學術報告50余次。任26個國際SCI期刊的編委會成員,18個基金評審機構專家,80余家期刊的同行評議專家及多個國家及國際科學機構的科學咨詢委員會成員。
吳軍,助理教授。分別于山東大學及田納西大學諾克斯維爾分?;竦昧俅慘窖а墾緩蛻镅Р┦墾?。經過南加州大學Martin Pera教授及索爾克生物學研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte教授實驗室的博士后培訓后,于2018年1月入職德克薩斯大學西南醫學中心,擔任分子生物學系助理教授。主要研究方向是利用多種技術手段開發新型干細胞,建立高效基因組和表觀基因組編輯工具,專注于利用種間嵌合體來研究進化背景下的發育生物學、身體和器官大小的確定、物種的特定行為特征、抗癌性以及物種屏障的分子基礎。在Nature、Cell等雜志發表SCI研究論文55篇。
于洋,副研究員。2009年于中國科學院動物研究所獲得理學博士學位(導師為周琪研究員),2010年加入北京大學第三醫院生殖醫學中心喬杰教授研究團隊,2018—2019年在美國索爾克生物學研究所以訪問學者形式開展研究工作。主要研究方向為病理條件下女性生殖細胞的發育調控機理及研究模型的建立。在Cell、PNAS、Cell Research等雜志發表SCI研究論文80余篇。



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1. Li R, Zhong C, Yu Y, Liu H, Sakurai M, Yu L, Min Z, Shi L, Wei Y, Takahashi Y et al: Generation of Blastocyst-like Structures from Mouse Embryonic and Adult Cell Cultures. Cell 2019, 179(3):687-702 e618.

2. ?Yan L, Yang M, Guo H, Yang L, Wu J, Li R, Liu P, Lian Y, Zheng X, Yan J et al: Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol 2013, 20(9):1131-1139.

3. Harrison SE, Sozen B, Christodoulou N, Kyprianou C, Zernicka-Goetz M: Assembly of embryonic and extraembryonic stem cells to mimic embryogenesis in vitro. Science 2017, 356(6334).


供稿單位:北京大學第三醫院

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